Terzo Report HS: Valutazione della crescita di biofilm su riporti galvanici

Nuovo protocollo sperimentale
La seguente serie di prove è stata eseguita al fine di standardizzare il metodo di valutazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa fatto crescere su superfici di diversa natura e in particolare su riporti galvanici.

Il procedimento  di misura è conforme a quello utilizzato in bibliografia. Sono stati testati due diversi metodi che però differiscono solamente nei tempi di prelievo dei coupon. Di seguito sono descritti in dettaglio entrambi

Metodo 1

  • I campioni vengono inseriti nel Biofilm Reactor. Nel reattore vengono posti 500ml di soluzione fisiologica e una brodocoltura di 10ml di Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (107 UFC/ml).
  • Il sistema viene mantenuto in condizioni stazionarie per 24 ore con una rotazione costante di 125 rpm a seguito delle quali si verifica la formazione di biofilm.
  • Dopo 24 ore viene prelevato il primo coupon e inserita nel reattore una soluzione nutriente fresca (TSB) in modo da raggiungere una concentrazione del 10% di nutrienti in fisiologica
  • Dopo 48 ore viene verificata la formazione di biofilm tramite estrazione di un secondo coupon ed inserita nel reattore una soluzione nutriente fresca (TSB) in modo da raggiungere una concentrazione del 50% di nutrienti in fisiologica.
  • Il giorno successivo (72h) viene nuovamente stimata la formazione di biofilm mediante estrazione del terzo coupon.

ESTRAZIONE DEI COUPONS
I campioni vengono estratti asetticamente facendo attenzione alle superfici che contengono il biofilm e sciacquati  2 volte con soluzione tampone, poi messi in provetta con 10 ml PBS.

RIMOZIONE DEI BATTERI DAL COUPONS

  • I coupons vengono sottoposti a 3 CICLI alternati di 30 SECONDI in ULTRASUONI a 42 kHz.
  • La soluzione viene sottoposta a VORTEX.
  • La soluzione viene poi disaggregata con OMOGENIZZATORE a 16000 rpm per 60 secondi.
  • A seguito delle opportune diluizioni la soluzione viene seminata su piastre di TSA e incubata a 37°C per 24h

Metodo 2

  • I campioni vengono inseriti nel Biofilm Reactor. Nel reattore vengono posti 500ml di soluzione fisiologica e una brodocoltura di 10ml di Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (107 UFC/ml).
  •  Il sistema viene mantenuto in condizioni stazionarie per 24 ore con una rotazione costante di 125 rpm a seguito delle quali si verifica la formazione di biofilm.
  • Dopo 24 ore viene estratto il primo coupon ed inserita nel reattore una soluzione nutriente fresca (TSB) in modo da raggiungere una concentrazione del 10% di nutrienti in fisiologica.
  • Dopo 24 ore viene estratto il secondo coupon ed inserita nel reattore una soluzione nutriente fresca (TSB) in modo da raggiungere una concentrazione del 50% di nutrienti in fisiologica.
  • Dopo 24h viene estratto il terzo coupon 48h per verificare la formazione di biofilm.
  • Dopo 48h viene estratto il quarto coupon 48h per verificare la formazione di biofilm.

ESTRAZIONE DEI COUPONS
I campioni vengono estratti asetticamente facendo attenzione alle superfici che contengono il biofilm e sciacquati  2 volte con soluzione tampone, poi messi in provetta con 10 ml PBS.

RIMOZIONE DEI BATTERI DAL COUPONS

  • I coupons vengono sottoposti a 3 CICLI alternati di 30 SECONDI in ULTRASUONI a 42 kHz
  • La soluzione viene sottoposta a VORTEX.
  • La soluzione viene poi disaggregata con OMOGENIZZATORE a 16000 rpm per 60 secondi.
  • A seguito delle opportune diluizioni la soluzione viene seminata su piastre di TSA e incubata a 37°C per 24h

Risultati ottenuti
Il metodo di misura utilizzato consente di eseguire una conta batterica dei vivi del biofilm, dopo averlo staccato meccanicamente dai coupon.
Nelle tabelle seguenti sono riportati i risultati ottenuti per tre tipi di coupon: policarbonato, vetro e Ruthenium Theta (rivestimento galvanico in cromo), espressi in UFC/cm2. Di seguito sono riportati  anche grafici e istogrammi relativi ai dati ottenuti, per una loro più immediata visualizzazione.